血液中存在着大量重要的低丰度分子标志物（fM级甚至更低），其浓度远低于临床分析技术的检测限（通常在pM级）。发展超灵敏分子检测技术，实现对低丰度分子标志物的准确检测，对于发现新的疾病分子标志物、提高疾病诊断准确度都具有重要的作用，是当前生物传感技术的前沿研究领域。实现超灵敏分子检测的一个重要手段是利用单分子技术，通过数字化的单个分子计数来反映样品中的实际分子浓度，如数字化ELISA技术，在蛋白分子检测中可以达到亚fM级的检测限。但现有技术多采用终点检测方式，通过探针分子捕获分析物后进行计数，其捕获到的分子数与反应时间受探针分子与分析物结合动力学及扩散速度的限制，同时样品中高浓度干扰分子的存在会造成大量的非特异性结合，导致检测时间过长、灵敏度和特异性不足等局限。

      余辉课题组提出了动态单分子传感的创新方法，利用单分子操控与分子结合动力学分析突破了以上检测机理上的限制，实现了快速超灵敏检测分子标志物。其基本原理包括：1）通过单分子结合动力学特征的分析来排除非特异性结合；2）通过累加分析反应过程中的分子结合事件总数量，而非平衡状态下捕获的分子数，来突破分子结合亲和力的限制；3）通过单颗粒操控技术调节分子结合动力学，提高结合-解离事件发生频率，增加可观测的分子结合事件数量；4）通过单颗粒操控提升分子扩散速度，缩短检测时间。课题组以microRNA和β-淀粉样蛋白为例，展示了该技术在15分钟内快速检测的能力，检测限达到fM级。

该工作是基于课题组前期发展的表面等离子体共振成像（surface plasmon resonance imaging, SPRI）单颗粒分析平台完成的，通过构建基于纳米颗粒的夹心反应体系，实现了对单分子结合的操控、动态观测以及动力学参数定量分析。该工作将经典的SPR生物传感技术从传统大量分子结合平均信号检测的集群分析方式，发展到了SPRI单分子结合动力学分析，并展现了在超灵敏分子检测中的独特优势，对SPR技术的未来发展具有重要的指导意义。这是余辉课题组自2017年建立以来，围绕SPRI单颗粒分析技术第二次在PNAS上发表高质量论文，此前曾在PNAS发表了基于SPRI的外泌体单颗粒异质性分析技术(PNAS, 2018, 115(41):10275-10280)。

单分子动态传感技术检测microRNA和蛋白分子。(A)单分子动态传感技术示意图：采用纳米粒子和SPRI系统构建单分子检测体系，并施加外力调控分子结合动力学；通过对纳米粒子的统计分析获得单分子结合动力学信息，排除非特异性结合来获得亚fM级检测限；(B)通过施加电场力调控，检测三种疾病相关的microRNA分子；（C）通过电场力或磁场力调控，在血清中检测Aβ1-42分子浓度，检测限达fg/mL级。

      相关论文以“Dynamic single-molecule sensing by actively tuning binding kinetics for ultrasensitive biomarker detection”为题，于3月1日在Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America在线刊登(doi:10.1073/pnas.2120379119)。论文第一作者为yd12300云顶线路博士生曾强，志愿者周笑颜(现为亚利桑那州立大学博士研究生)和yd12300云顶线路电子信息与电气工程学院杨玉婷副教授为论文的共同第一作者；yd12300云顶线路余辉副教授和清华大学化学系李景虹院士为论文的共同通讯作者。该研究工作得到了NSFC国家重大科研仪器研制项目的支持。

原文链接：https://www.pnas.org/doi/10.1073/pnas.2120379119

供稿单位：科研与学科办

作者：余辉

审核：古宏晨